PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR er en kædereaktion, hvorved genetisk arvemateriale (DNA eller RNA) hurtigt kan opformeres til mængder, der kan detekteres. PCR detektion er ofte et hurtigere og mere følsomt alternativ til påvisning ved de traditionelle dyrkningsmetoder. Patogene organismer som virus, bakterier og parasitter indeholder alle DNA eller RNA, som er specifikt for det pågældende patogen. Ved hjælp af PCR kan man derfor detektere og skelne mellem forskellige patogener.

Ved PCR opformeres et lille stykke af den patogene organismes arvemateriale ud fra to korte syntetisk fremstillede DNA stykker (primere). Primerne er designet således, at de kun kan genkende netop den patogene organisme, eller gruppe af patogener, der ønskes undersøgt for. PCR foregår typisk ved at RNA eller DNA først ekstraheres fra det prøvemateriale, der ønskes undersøgt, f.eks. lungevæv, svabere eller serum. Dernæst blandes DNA/RNA med bl.a. primerne, og der tilsættes et enzym (polymerasen), som katalyserer kædereaktionen ved relativt høj temperatur (ca. 70oC).

Ved at regulere temperaturen op og ned 30-40 gange, vil DNA-stykket beliggende mellem de to specifikke primere (PCR produktet) blive opformeret til mængder, som kan synliggøres i et gel-elektroforese system, hvor PCR-produkter farves og adskilles efter størrelse. Hvis et prøvemateriale ikke indeholder DNA eller RNA, der passer til primerne, vil der ikke kunne ske en opformering af DNA/RNA, og prøven vil fremstå negativ.

Real-time PCR
En anden, og i dag mere anvendt metode til detektion ved PCR, er ”real-time PCR”, hvor reaktionen følges over tid. Ved real-time PCR tilsættes fluoroforer, enten i form af korte stykker DNA mærket med fluoroscensmolekyler, som specifikt kan binde sig til PCR produktet, eller i form af et fluorescerende farvestof, der binder sig til PCR produktet. Under PCR reaktionen udsendes fluorescens, som måles løbende i en real-time PCR maskine.

Ved positive prøver vil flourescensen oversstige en defineret cut-off værdi efter et vist antal cyklusser, som bl.a. afhænger af mængden/koncentrationen af DNA i prøven. Metoden kan derved indstilles til at give et kvantitativt mål for indholdet af det pågældende patogen i prøvematerialet. Dette kan være afgørende for at stille en diagnose. Et eksempel herpå er PCV2 virus, som kan findes i raske grise, og som kun associeres med sygdom, når der er massive mængder af virus tilstede.

Hos Center for Diagnostik DTU benyttes efterhånden real-time PCR til de fleste af de PCR-test, som anvendes i rutinediagnostikken i større omfang, og Instituttet råder over ekspertise i udvikling af nye PCR-test til anvendelse inden for både diagnostik og forskning.

https://diagnostik.dtu.dk/ydelser/diagnostiske-analyser/metoder/pcr?fbclid=IwAR1LuGcHudVhAsuVnuwEJi8jKR1oomzVB6AE0ZLwMRIYe7cVZUEBhDxjOW0
8 AUGUST 2020